目的

睾丸组织驻留巨噬细胞是固有免疫系统抵御病原体的第一道应答细胞，同时还发挥着许多尚不为人熟知的日常生理功能。研究睾丸巨噬细胞可借助多种实验技术，流式细胞术便是其中之一。

流式细胞术是一种功能强大的研究手段，能够分别在单细胞水平和细胞群体水平对巨噬细胞开展分析。利用流式细胞术检测睾丸巨噬细胞时，需要经过专门的组织处理流程来获取该类细胞。在Protocol阐述如何分离睾丸巨噬细胞并区分不同巨噬细胞亚群进行分析。

背景

巨噬细胞是广泛分布于全身各组织的固有免疫细胞[1]，作为专职吞噬细胞，构成机体抵御病原体的第一道防线[2]。同时，巨噬细胞还承担多种组织稳态功能[3]。例如，乳腺巨噬细胞参与维持细胞外基质的更新重塑[4]，脾脏红髓巨噬细胞负责机体铁离子的循环回收[5]。不同组织中存在多种巨噬细胞亚型，各亚型表达的标志物组合各不相同。在小鼠睾丸中，主要可区分两类巨噬细胞亚群：MHCII阳性巨噬细胞与CD206阳性巨噬细胞[6]。目前可通过多种实验技术对上述细胞亚群进行表型鉴定，其中流式细胞术是最常用的方法之一。

睾丸是一个同时支持精子发生和类固醇生成这两项基本功能的器官，其稳态通过生精小管内外空间上组织排列的各种细胞类型之间的密切相互作用得以维持。这些细胞包括生殖细胞、支持细胞、Leydig细胞、管周肌样细胞、血管内皮细胞以及巨噬细胞等免疫细胞。

睾丸巨噬细胞是睾丸中最丰富的白细胞，从胚胎发育到出生后生长期间，构成了间质细胞群体的主要部分。在成年睾丸中，已鉴定出两种组织驻留巨噬细胞群体。管周巨噬细胞位于生精小管表面，紧邻管周肌样细胞；间质巨噬细胞则位于睾丸间质内，与Leydig细胞密切接触。

图1.睾丸细胞构成示意图。在稳态条件下，间质巨噬细胞（iTM）和管周巨噬细胞（pTM）占主导地位。iTM的特征为CD64^hi MHC II^lo表达，位于Leydig细胞和血管附近。相比之下，pTM的特征为CD64^lo MHC II^hi表达，位于生精小管附近[9]。

睾丸组织驻留巨噬细胞被认为在发育和成年期间发挥多种功能。在胚胎时期，它们调控血管化和形态发生。在体内稳态条件下，组织驻留巨噬细胞据报道可提供合适的组织微环境以支持Leydig细胞功能，并协助精原细胞的分化。睾丸巨噬细胞还被认为参与维持睾丸的免疫抑制环境。

近十年来，流式细胞术已成为在单细胞水平探索和鉴定蛋白表达的强大技术手段。该技术利用荧光标记抗体特异性结合目标细胞的表面标志物[7]，当细胞逐个通过激光检测通道时，仪器可识别对应的荧光信号。同时，流式细胞术还可根据细胞的光散射特性区分细胞大小与颗粒度。仪器将光学信号转化为数字化数据，可通过Diva、FlowJo、Cytobank等专业软件完成数据分析。

在同一检测面板中搭配多种荧光抗体进行多色流式检测时，会产生荧光溢漏现象，需要通过补偿校正消除干扰[8]。实验可通过单管单染样本（细胞或微球）采集信号，借助流式软件计算并生成补偿矩阵。若初始补偿参数不理想，可在数据分析阶段进一步优化。流式数据通常以二维散点图呈现，研究者可通过设门策略圈选并鉴定目标细胞群。

巨噬细胞属于组织固着细胞，难以直接从组织中分离获取，因此必须通过酶消化法实现细胞分离（Cell-Out®通用型组织单细胞酶解液）。本实验方案将详细介绍适用于流式细胞术检测的小鼠睾丸巨噬细胞分离与制备方法。

操作步骤：

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参考文献

1.Hume D A, Irvine K M, Pridans C. (2019). The mononuclear phagocyte system: the relationship between monocytes and macrophages. Trends in Immunology, 40(2), 98‑112. https://doi.org/10.1016/j.it.2018.11.007

2.Sheu K M, Hoffmann A. (2022). Functional hallmarks of healthy macrophage responses: their regulatory basis and disease relevance. Annual Review of Immunology, 40, 295‑321. https://doi.org/10.1146/annurev‑immunol‑101320‑031555

3.Nobs S P, Kopf M. (2021). Tissue‑resident macrophages: guardians of organ homeostasis. Trends in Immunology, 42(6), 495‑507. https://doi.org/10.1016/j.it.2021.04.007

4.Wang Y, Chaffee T S, LaRue R S, Huggins D N, Witschen P M, Ibrahim A M, Nelson A C, Machado H L, Schwertfeger K L. (2020). Tissue‑resident macrophages promote extracellular matrix homeostasis in the mammary gland stroma of nulliparous mice. eLife, 9. https://doi.org/10.7554/eLife.57438

5.Bellomo A, Mondor I, Spinelli L, Lagueyrie M, Stewart B J, Brouilly N, Malissen B, Clatworthy M R, Bajenoff M. (2020). Reticular fibroblasts expressing the transcription factor WT1 define a stromal niche that maintains and replenishes splenic red pulp macrophages. Immunity, 53(1), 127‑142.e127. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.06.008

6.Lokka E, Lintukorpi L, Cisneros‑Montalvo S, Makela J A, Tyystjarvi S, Ojasalo V, Gerke H, Toppari J, Rantakari P, Salmi M. (2020). Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis. Nature Communications, 11(1), 4375. https://doi.org/10.1038/s41467‑020‑18206‑0

7.McKinnon K M. (2018). Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology, 120, 5.1.1‑5.1.11. https://doi.org/10.1002/cpim.40

8.Szaloki G, Goda K. (2015). Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry Part A, 87(11), 982‑985. https://doi.org/10.1002/cyto.a.22736

9.Bhushan S, Theas MS, Guazzone VA, Jacobo P, Wang M, Fijak M, Meinhardt A and Lustig L (2020) Immune Cell Subtypes and Their Function in the Testis. Front. Immunol. 11:583304. doi: 10.3389/fimmu.2020.583304